Medeia RAGE acelerado enxerto de veia diabética Aterosclerose induzida pelo estresse mecânico combinado e AGEs através da ativação da ERK Synergistic

Medeia RAGE acelerado enxerto de veia diabética Aterosclerose induzida pelo estresse mecânico combinado e AGEs através da ativação da ERK Synergistic

Diabetes e hipertensão são fatores de risco independentes de aterosclerose. No entanto, até 70% dos pacientes com diabetes tipo 2 e até 40% dos pacientes com diabetes do tipo 1 têm arterial hipertensão arterial [1,2]. A combinação de diabetes e hipertensão pode amplificar ou acelerar o desenvolvimento e progressão da aterosclerose [3,4,5]. Pode haver um cut-em comum ponto ou caminho entre diabetes e hipertensão relacionada à acelerada remodelação vascular. Se assim for, seria muito valioso no tratamento de diabetes com e sem hipertensão. Diabetes relacionada com lesão vascular está intimamente associado com o deposição de produtos de glicação avançada (AGE) como um resultado da hiperglicemia prolongada por reações não enzimáticas entre proteínas de glicose e de longa duração (por exemplo, colágeno da parede vascular), lípidos e ácidos nucleicos no plasma e nos tecidos [6,7,8].

Estes proteínas modificadas interagir com o receptor AGE (RAGE) para iniciar sinalização intracelular, por exemplo, quinase sinal-regulado extracellular (ERK) ativação [9]. Isso desencadeia estrutura vascular alterada e função, o que acelera a progressão da aterosclerose e hipertensão em pacientes diabéticos ou animais [10,11,12,13, 14,15,16]. Uma vez que a hipertensão ocorre, hipertensão induzida por anormal biomecânico alongamento torna-se o estímulo predominante [17 18,19]. Hipertensão aumenta o estresse tensão cíclica na paredes arteriais por tanto como 30%, o que induz VSMC hipertrofia e hiperplasia [17,18,19,20,21,22,23].

Isto leva a resistência vascular periférica e continuamente elevados do formação de macrovascular neoíntima. As safenas condutas venosos para cirurgia de revascularização miocárdica (CRM), em pacientes com doença isquêmica do coração também suportar aumentado rapidamente pressão arterial, resultando na doença de enxerto de veia oclusiva em quase metade das condutas dentro de 10 anos. Pacientes com diabetes são particularmente em risco [20]. Isto implica que as artérias e de bypass da veia enxertos em pacientes diabéticos com hipertensão experiência combinada estimulação de AGEs, devido a hiperglicemia prolongada e cíclica alongamento induzido pelo aumento da pressão arterial [6,7,15,16,17, 18,19,21,22,23,24,25]. Até o momento, o mecanismo subjacente que esta estimulação combinada desencadeia vascular acelerada remodelação permanece incerto [5,26].

Murino venosa aterosclerose bypass in vivo e celular sinais induzidos por cíclico estiramento mecânico in vitro são muito dois modelos importantes, que permitem estudo mecanicista da neointimal formação ea sua relação com a hipertensão, com e sem diferentes distúrbios metabólicos [15,22]. Química bem conhecida certa materiais (hormônios, idade, e drogas) podem ser especificamente se ligarem aos seus receptores, desencadeando a activação de sinal individual caminhos. No entanto, até à data, não existem dados disponíveis sobre a presença de quaisquer mecanoceptores específicos existentes em células em resposta ao stress mecânico. Os meios pelos quais o vascular células sentido e estimulação mecânica em transdução intracelular sinais bioquímicos e que medeiam receptores esses sinais permanece obscuro.

Vários estudos anteriores indicaram que alguns transmembranar receptores por exemplo, PDGFa-receptor em VSMCs, a angiotensina II digitar um receptor na cardiócitos, e FLK-1 e integrinas na células endoteliais podem ser diretamente ativados por estresse mecânico como mecanoceptores [23,27,28], resultando na fosforilação ERK aumentou e proliferação celular [29]. Assumindo que a raiva é um tipo de receptor transmembranar presente em VSMCs, nós propuseram que RAGE seria um sensor comum, capaz de sinais simultaneamente mediadoras induzidas por estiramento mecânico e AGEs, contribuindo para o remodelamento vascular em pacientes com diabetes e hipertensão. No presente estudo, determinou-se o impacto do diabetes com hipertensão em neointimal enxerto de veia formação e que o seu mecanismo envolve o sinal de RAGE / ERK caminho. Este estudo fornece novos alvos para o desenvolvimento de drogas e novas estratégias para a prevenção e tratamento de doença vascular doenças em pacientes com diabetes com hipertensão.

Métodos
Uma secção de métodos expandido está disponível em S1 de dados. Os animais experimentais Todos os procedimentos animais eram consistentes com a National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Laboratório Animais e aprovadas pela Comissão Animal Care e Uso de Sun Yat-sen University e semelhante aos protocolos descritos anteriormente [25,29,30,31]. Em breve, C57BL de três meses, do sexo masculino / 6J ratinhos foram adquiridos a partir do centro instalação para animais de Sun Yatsen University (Guangzhou, China) e mantidos sob uma luz / escuro ciclo (12/12 h) em 24uC e recebeu alimento e água ad libitum antes da experimentação.

Veia enxerto de ratos diabéticos in vivo Os ratos foram usados como doadores e receptores de enxertos de veia (N = 50, respectivamente) e divide-se em um enxerto de veia não-diabéticos grupo e um grupo de enxerto de veia diabética. A indução de diabetes experimental foi semelhante ao descrito por Zauli [30]. Os destinatários recebeu sete intraperitoneal diária consecutiva injecções de 50 mg / kg de estreptozotocina (STZ) (Sigma) (diabética
camundongos, ratos D) ou tampão citrato (ratos diabéticos, ratos ND) (N = 25, respectivamente). Concentrações de glicose no sangue foram medidos
uma semana depois e hiperglicemia (nível de glicose no sangue 0,16 mmol / L) foi confirmado no grupo diabético (N = 24). Os ratinhos foram submetidos a cirurgia de enxerto de veia de um modo semelhante ao descrito anteriormente [25,32]. Em suma, o direito comum artéria carótida do destinatário foi mobilizado a partir do torácica entrada para a bifurcação, dividido em seu ponto médio, invertido sobre o braçadeira de polietileno e fixados com 8-0 suturas de seda. O supradiafragmático veia cava de um rato isogênica ninhada doador foi colhido e manga ao longo dos punhos 2 e ligado como um
interposição de enxerto. Pulsações vigorosas confirmado com sucesso enxerto.

Para análise histológica, a perfusão foi realizada como descrito anteriormente [25]. Após os ratinhos foram colocados sob anestesia utilizando pentobarbital sódico (50 mg de peso corporal / kg, ip), o sangue foi coletadas de cada átrio esquerdo do mouse para medição por AGE espectroscopia [33] (Varian, Califórnia, EUA). As amostras foram perfusão-fixadas com 0,9% de NaCl e paraformaldeído a 4%. O enxertos de veias foram colhidas em 0, 4 e 8 semanas após a operação e parafina (N = 7, respectivamente) [25]. Seções de exemplo 7 mm de espessura foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e examinadas ao microscópio (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). A espessura da parede do vaso enxertado, incluindo a distância
entre a íntima lúmen e adventícia, foi determinada por medindo quatro regiões de cada seção transversal.

Coloração imuno-histoquímica Procedimentos estavam de acordo com os protocolos fornecidos pela Abcam (www.abcam.com / técnico). Resumidamente, serial parafina secções foram coradas com um anticorpo actina de músculo liso (1:200, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) anticorpo AGE, (1:200, Abbiotec, San Diego, EUA), ou anticorpos RAGE (1:100, Santa Cruz, Califórnia, EUA) ou o anticorpo Ki-67 (1:100, Santa Cruz) ou fosforilada ERK1 / 2 (pERK1 / 2) anticorpo (1:200, sinal celular Tech., Inc., EUA). As secções foram incubados com rábano peroxidase (HRP)-anticorpo secundário conjugado foram desenvolvidos com cromógeno (diaminobenzidina 3,39, DAB) (castanho) e contrastado com hematoxilina (azul). Eles foram então inspeccionado
e fotografados sob microscopia de luz visível (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). As secções com TRITC-conjugado anticorpo secundário foram contrastadas com 49, 6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) (azul). Eles foram inspecionados e fotografado usando microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão).

Células núcleos e Ki-67-positivo foram contados e analisados. Ativo células em proliferação foram identificados por Ki-67-positivo de coloração, e o índice de proliferação foi calculada como a percentagem de activa proliferação de células versus a contagem total de células. A cultura celular VSMCs foram isolados por digestão enzimática da aorta de Ratinhos C57BL/6J usando uma modificação do procedimento como descrito anteriormente [29,31]. As células isoladas cultivadas em silicone elastómero de fundo, gelatina revestidos placas de 6 poços de cultura foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) (Vida Technologies, Califórnia, EUA) suplementado com 10% de vitela fetal soro, penicilina e estreptomicina a 37uC num humidificada atmosfera de CO2 5%.

Preparação AGE
AGEs foram preparados de um modo semelhante ao descrito por Kim [34]. Em resumo, 1 mM de ácido gordo livre de BSA foi dissolvido em PBS com 0,5 M de glucose e incubadas sob condições de estéril para 8 semanas em 37uC. As misturas reaccionais foram dialisadas contra salino tamponado com fosfato (PBS) para remover a glicose livre e, em seguida, passado através de uma coluna específica (Pierce, Illinois, EUA) para remover
quaisquer endotoxinas. Non-glicosilada controlo BSA foi submetido à mesmas condições, exceto que a glicose foi omitido. AGEs foram identificado por fluorescência espectrofotometria [33].

Estresse tensão cíclica VSMCs tratados foram submetidos a tensão de estiramento cíclico como descrito anteriormente [29,35]. Soro sedentos VSMCs alcançando Confluência de 70% foram submetidos a tensão de estiramento cíclico com um controlado por computador unidade estresse cíclico [35]. Deformação cíclico (60 ciclos / min) A realização de 5% a 20% de alongamento na elastomerbottomed placas foi realizada com e sem AGEs. Tratamento com células RAGE pequeno RNA de interferência (siRNA-RAGE) tratados com VSMCs Foram soro-starved e submetida a alongamento com cíclico e sem AGEs. Eles foram então colhidas para análise de Western blot e coloração imunocitoquímica para avaliar de Ki-67 expressão (Ver abaixo). Utilizou-se os procedimentos fornecidos pelo Origene para estabelecer estáveis linhas VSMC expressando RAGE. Células resistentes monoclonais seleccionada por G418 foram utilizados para a experiência correspondente. Análise de mancha de western Procedimentos foram semelhantes aos descritos anteriormente, com
ligeiras modificações [29]. VSMCs tratados foram colhidos em lise tamponar o uso de inibidores de protease. A suspensão foi lisado centrifugadas e concentração de proteína foi avaliada utilizando um Bio-Rad ensaio de proteína. Heat-desnaturados proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para nitrocelulose membranas. Estes foram sondadas com anticorpos contra fosforilado ERK1 / 2 (regalias) e RAGE e reprobed com bactin anticorpo. As bandas foram visualizadas usando o reforço sistema de detecção de quimioluminescência (ECL). A intensidade foi
quantificada por densitometria.

RNA de interferência Os procedimentos usados para esta experiência foi semelhante à que descrito por Villacorta [36]. Os RAGE pequeno RNA de interferência (SiRNA-RAGE) alvo seqüências duplex [NM_007425] (Sense: 59 -GAGACACCCUGAGACGGGACUCUUU-39; Antisense: 59 -AAAGAGUCCCGUCUCAGGGUGUCUC-39) foram sintetizados por Invitrogen (Carlsbad, EUA). Um siRNA não-alvo sequência duplex (Invitrogen StealthTM RNAi) foi utilizado como um controlo negativo. Transfecção VSMCs foi realizada de acordo com recomendações do fabricante. Soro sedentos VSMCs
foram submetidos a tensão de estiramento cíclico na ausência ou na presença de idades para 10 minutos para análise de Western blot ou durante 1 hora.
Eles foram cultivadas durante um período adicional de 24 horas para imunocitoquímica coloração.

A análise estatística Todas as análises foram realizadas com SPSS 16,0 (SPSS Inc, Chicago, EUA). As variáveis contínuas são apresentados como média 6 SEM e as variáveis categóricas são apresentadas como números reais e porcentagens. ANOVA foi utilizado para variáveis contínuas e qui-quadrado e exato de Fisher foram usados para categórica variáveis. Não houve valores perdidos, e os valores de P foram ajustado para comparações múltiplas de dados quer com o Scheffe ' ou modificados método de Bonferroni. Valores de P, 0,05 foram considerados significativo.